Kit Rakaman TIANSeq mRNA

Pada masa ini, teknologi penjujukan proses yang tinggi berdasarkan terutamanya pada teknologi penjujukan generasi akan datang. Oleh kerana panjang bacaan teknologi penjujukan generasi akan datang terhad, kita mesti memecahkan urutan panjang penuh ke perpustakaan serpihan kecil mengikut urutan. Mengikut keperluan eksperimen penjujukan yang berbeza, kita biasanya memilih penjujukan urutan tunggal atau penjujukan akhir dua kali. Pada masa ini serpihan DNA dari perpustakaan penjujukan generasi seterusnya secara amnya diedarkan dalam julat 200-800 bp.

a) DNA kurang berkualiti dan mengandungi perencat. Gunakan sampel DNA berkualiti tinggi untuk mengelakkan penghambatan aktiviti enzim.

b) Jumlah sampel DNA tidak mencukupi semasa menggunakan kaedah bebas PCR untuk membina perpustakaan DNA. Apabila input DNA terpecah melebihi 50 ng, aliran kerja bebas PCR dapat dilakukan secara selektif semasa proses pembinaan perpustakaan. Sekiranya bilangan salinan perpustakaan terlalu rendah untuk diuraikan secara langsung, perpustakaan DNA dapat diperkuat dengan PCR setelah penyesuaian adaptor.

c) Pencemaran RNA membawa kepada pengukuran DNA awal yang tidak tepat. Pencemaran RNA mungkin berlaku dalam proses pemurnian DNA genom, yang boleh menyebabkan pengukuran DNA yang tidak tepat dan pemuatan DNA yang tidak mencukupi semasa pembinaan perpustakaan. RNA boleh dikeluarkan dengan merawat dengan RNase.

A-1

a) Fragmen kecil (60 bp-120 bp) muncul Fragmen kecil biasanya pecahan penyesuai atau dimer yang dibentuk oleh penyesuai. Pemurnian dengan manik magnet Agencourt AMPure XP dapat menghilangkan serpihan penyesuai ini dengan berkesan dan memastikan kualiti penjujukan.

b) Fragmen besar muncul di perpustakaan setelah penguatan PCR Saiz serpihan DNA perpustakaan akan meningkat sebanyak 120 bp setelah penyesuai diikat. Sekiranya serpihan DNA meningkat lebih dari 120 bp setelah ligasi penyesuai, itu mungkin disebabkan oleh penguatan fragmen abnormal penguatan PCR yang berlebihan. Mengurangkan bilangan kitaran PCR dapat mengelakkan keadaan.

c) Saiz serpihan DNA perpustakaan yang tidak normal selepas penyesuaian penyesuai Panjang penyesuai dalam kit ini ialah 60 bp. Apabila dua hujung serpihan dihubungkan ke penyesuai, panjangnya hanya akan meningkat sebanyak 120 bp. Apabila menggunakan penyesuai selain yang disediakan oleh kit ini, sila hubungi pembekal untuk memberikan maklumat yang relevan seperti panjang penyesuai. Pastikan aliran kerja dan operasi eksperimen mengikuti langkah-langkah yang dijelaskan dalam manual.

d) Ukuran serpihan DNA yang tidak normal sebelum penyesuaian penyesuai Sebab masalah ini mungkin disebabkan oleh keadaan reaksi yang salah semasa pemecahan DNA. Masa tindak balas yang berbeza harus digunakan untuk input DNA yang berbeza. Sekiranya input DNA lebih dari 10 ng, kami mengesyorkan untuk memilih masa tindak balas 12 min sebagai waktu permulaan untuk pengoptimuman, dan ukuran serpihan yang dihasilkan pada masa ini terutama dalam julat 300-500 bp. Pengguna dapat menambah atau menurunkan panjang fragmen DNA selama 2-4 min mengikut keperluan mereka sendiri untuk mengoptimumkan serpihan DNA dengan ukuran yang diperlukan.

A-2

a) Waktu pecahan tidak dioptimumkan Sekiranya DNA yang terfragmentasi terlalu kecil atau terlalu besar, sila rujuk Garis Panduan Pemilihan Waktu Fragmentasi yang diberikan dalam arahan untuk menentukan masa reaksi, dan gunakan titik waktu ini sebagai kawalan, dan tetapkan sistem tindak balas untuk memanjangkan atau memendekkan 3 min untuk membuat penyesuaian yang lebih tepat pada masa pemecahan.

A-3

Taburan ukuran DNA yang tidak normal selepas rawatan fragmentasi

a) Kaedah pencairan reagen fragmentasi yang salah, atau reagen tidak dicampur sepenuhnya selepas pencairan. Cairkan reagen 5 × Fragmentation Enzyme Mix di atas ais. Setelah dicairkan, campurkan reagen secara merata dengan menjentikkan bahagian bawah tiub dengan lembut. Jangan putar reagen!

b) Sampel input DNA mengandungi EDTA atau bahan pencemar lain Penipisan ion garam dan agen khelat dalam langkah pemurnian DNA sangat penting untuk kejayaan percubaan. Sekiranya DNA dilarutkan dalam 1 × TE, gunakan kaedah yang diberikan dalam arahan untuk melakukan pemecahan. Sekiranya kepekatan EDTA dalam larutan tidak pasti, disarankan untuk membersihkan DNA dan melarutkannya dalam air deionisasi untuk tindak balas berikutnya.

c) Pengukuran DNA awal yang tidak tepat Ukuran DNA berpecah berkait rapat dengan jumlah input DNA. Sebelum rawatan pemecahan, pengukuran DNA yang tepat menggunakan Qubit, Picogreen dan kaedah lain sangat penting untuk menentukan jumlah DNA yang tepat dalam sistem tindak balas.

 d) Penyediaan sistem tindak balas tidak mengikut arahan Penyediaan sistem tindak balas berpecah mesti dilakukan di atas ais dengan ketat mengikut arahan. Untuk memastikan kesan terbaik, semua komponen reaksi hendaklah diletakkan di atas ais dan penyediaan sistem tindak balas harus dilakukan setelah penyejukan lengkap. Setelah penyediaan selesai, sila jentik atau pipet hingga sebati. Jangan berpusing!

1. Kaedah pencampuran yang tidak betul (pusaran, ayunan ganas, dan lain-lain) akan menyebabkan penyebaran serpihan perpustakaan yang tidak normal (seperti yang ditunjukkan dalam gambar berikut), sehingga mempengaruhi kualiti perpustakaan. Oleh itu, semasa menyiapkan larutan reaksi Fragmentation Mix, sila perlahan-lahan pipet ke atas dan ke bawah untuk mencampurkan, atau gunakan hujung jari untuk menjentikkan dan mencampur rata. Hati-hati agar tidak bercampur dengan pusaran.

2. DNA dengan ketulenan tinggi mesti digunakan untuk pembinaan perpustakaan

■ Keutuhan DNA yang baik: Jalur elektroforesis melebihi 30 kb, tanpa mengekor

■ OD260 / 230:> 1.5

■ OD260 / 280: 1.7-1.9

3. Jumlah input DNA mestilah tepat Dianjurkan untuk menggunakan kaedah Qubit dan PicoGreen untuk mengukur DNA, bukannya Nanodrop.

4. Kandungan EDTA dalam larutan DNA mesti ditentukan EDTA mempunyai pengaruh besar terhadap reaksi fragmentasi. Sekiranya kandungan EDTA tinggi, pemurnian DNA perlu dilakukan sebelum ujian berikutnya.

5. Penyelesaian tindak balas pemecahan mesti disediakan di atas es. Proses pemecahan sensitif terhadap suhu dan masa tindak balas (terutamanya setelah menambahkan penambah). Untuk memastikan ketepatan masa reaksi, sediakan sistem tindak balas di atas ais.

6. Masa tindak balas pemecahan mestilah tepat Masa tindak balas langkah pemecahan secara langsung akan mempengaruhi ukuran produk serpihan, sehingga mempengaruhi pengagihan saiz serpihan DNA di perpustakaan.

1. Jenis sampel apa yang sesuai untuk kit ini?

Jenis sampel kit yang boleh digunakan ialah RNA total atau mRNA yang disucikan dengan integriti RNA yang baik. Sekiranya jumlah RNA digunakan untuk membangun perpustakaan, disarankan untuk menggunakan kit penipisan rRNA (Cat # 4992363/4992364/4992391) untuk membuang rRNA terlebih dahulu.

2. Bolehkah sampel FFPE digunakan untuk membina perpustakaan dengan kit ini?

MRNA dalam sampel FFPE akan menurun ke tahap tertentu, dengan integriti yang lemah. Semasa menggunakan kit ini untuk pembinaan perpustakaan, disarankan untuk mengoptimumkan masa pemecahan (memendekkan waktu pemecahan atau tidak melakukan pemecahan).

3. Dengan menggunakan langkah pemilihan ukuran yang disediakan dalam manual produk, apa yang dapat menyebabkan segmen yang dimasukkan tampak sedikit penyimpangan?

Pemilihan ukuran harus dilakukan dengan ketat sesuai dengan langkah pemilihan ukuran dalam manual produk ini. Sekiranya terdapat penyimpangan, alasannya mungkin bahawa manik-manik magnet tidak seimbang dengan suhu bilik atau tidak bercampur sepenuhnya, pipet tidak tepat atau cecair tetap di hujungnya. Sebaiknya gunakan petua dengan penjerapan rendah untuk percubaan.

4. Pemilihan penyesuai dalam pembinaan perpustakaan

Kit pembinaan perpustakaan tidak mengandungi reagen penyesuai, dan disarankan untuk menggunakan kit ini bersama dengan TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC perpustakaan

Pengesanan kuantitatif perpustakaan: Qubit dan qPCR digunakan untuk menentukan kepekatan jisim dan kepekatan molar perpustakaan masing-masing. Operasi ini betul-betul sesuai dengan manual produk. Kepekatan perpustakaan pada amnya akan memenuhi keperluan penjujukan NGS. Pengesanan julat perpustakaan: Menggunakan Agilent 2100 Bioanalyzer untuk mengesan julat taburan perpustakaan.

6. Pemilihan nombor kitaran penguat

Menurut petunjuk, jumlah kitaran PCR adalah 6-12, dan jumlah kitaran PCR yang diperlukan harus dipilih sesuai dengan input sampel. Di perpustakaan hasil tinggi, penguatan lebih biasanya berlaku dalam pelbagai tahap, yang ditunjukkan oleh puncak yang sedikit lebih besar setelah puncak julat sasaran dalam pengesanan Agilent 2100 Bioanalyzer, atau kepekatan Qubit yang dikesan lebih rendah daripada qPCR. Penguatan lebih ringan adalah fenomena biasa, yang tidak mempengaruhi penjujukan perpustakaan dan analisis data seterusnya.

7. Lonjakan muncul dalam profil pengesanan Agilent 2100 Bioanalyzer

Kemunculan lonjakan dalam pengesanan Agilent 2100 Bioanalyzer adalah kerana pecahan sampel yang tidak rata, di mana akan terdapat lebih banyak pecahan dalam ukuran tertentu, dan ini akan menjadi lebih jelas setelah pengayaan PCR. Dalam hal ini, disarankan untuk tidak melakukan pemilihan ukuran, yaitu mengatur kondisi pemecahan menjadi 94 ° C selama 15 menit diinkubasi, di mana taburan serpihan kecil dan pekat, dan homogenitas dapat ditingkatkan.