Campuran PCR 2 × Pfu

Templat A-1

■ Templat mengandungi kekotoran protein atau perencat Taq, dan lain-lain —— Sucikan templat DNA, keluarkan kotoran protein atau ekstrak DNA templat dengan alat penulenan.

■ Denaturasi templat tidak lengkap - Menambah suhu denaturasi dengan tepat dan memanjangkan masa denaturasi.

■ Kerosakan templat ——Menyiapkan semula templat.

Primer A-2

■ Kualiti primer yang buruk ——Menyusun semula primer.

■ Degradasi primer ——Ambilkan primer berkepekatan tinggi menjadi sedikit untuk pengawetan. Elakkan pembekuan dan pencairan berulang atau jangka panjang 4 ° C.

■ Reka bentuk primer yang tidak betul (mis. Panjang primer tidak mencukupi, dimer terbentuk antara primer, dll.) -Perancangan reka bentuk semula (elakkan pembentukan dimer primer dan struktur sekunder)

A-3 Mg²⁺kepekatan

■ Mg²⁺ kepekatan terlalu rendah —— Meningkatkan Mg dengan betul²⁺ kepekatan: Mengoptimumkan Mg²⁺ kepekatan oleh rangkaian tindak balas dari 1 mM hingga 3 mM dengan selang 0.5 mM untuk menentukan Mg optimum²⁺ kepekatan untuk setiap templat dan buku asas.

A-4 Suhu penyepuhlindapan

■ Suhu penyepuhlindapan yang tinggi mempengaruhi pengikatan primer dan templat. ——Mengurangkan suhu penyepuhlindapan dan mengoptimumkan keadaan dengan kecerunan 2 ° C.

Masa lanjutan A-5

■ Masa perpanjangan yang pendek —— Menambah masa lanjutan.

Fenomena: Sampel negatif juga menunjukkan jalur urutan sasaran.

A-1 Pencemaran PCR

■ Pencemaran silang dari urutan sasaran atau produk penguat ——Hati-hati untuk tidak memasukkan sampel yang mengandungi urutan sasaran dalam sampel negatif atau menumpahkannya keluar dari tabung empar. Reagen atau peralatan harus ditutup secara autoklaf untuk menghilangkan asid nukleik yang ada, dan keberadaan pencemaran harus ditentukan melalui eksperimen kawalan negatif.

■ Pencemaran reagen ——Aliot reagen dan simpan pada suhu rendah.

A-2 Perdanar

■ Mg²⁺ kepekatan terlalu rendah —— Meningkatkan Mg dengan betul²⁺ kepekatan: Mengoptimumkan Mg²⁺ kepekatan oleh rangkaian tindak balas dari 1 mM hingga 3 mM dengan selang 0.5 mM untuk menentukan Mg optimum²⁺ kepekatan untuk setiap templat dan buku asas.

■ Reka bentuk primer yang tidak betul, dan urutan sasaran mempunyai homologi dengan urutan bukan sasaran. --— Reka bentuk primer.

Fenomena: Jalur penguat PCR tidak konsisten dengan ukuran yang diharapkan, sama ada besar atau kecil, atau kadang-kadang kedua-dua jalur penguat khusus dan jalur penguat tidak spesifik berlaku.

Primer A-1

■ Kekhususan primer yang lemah

--— Reka bentuk semula primer.

■ Kepekatan primer terlalu tinggi ——Meningkatkan suhu denaturasi dengan betul dan memanjangkan masa denaturasi.

A-2 Mg²⁺ kepekatan

■ Majlis²⁺ kepekatan terlalu tinggi ——Mengurangkan kepekatan Mg2 + dengan betul: Optimumkan Mg²⁺ kepekatan oleh rangkaian tindak balas dari 1 mM hingga 3 mM dengan selang 0.5 mM untuk menentukan Mg optimum²⁺ kepekatan untuk setiap templat dan buku asas.

A-3 Polimerase termostabil

■ Jumlah enzim yang berlebihan ——Mengurangkan jumlah enzim dengan tepat pada selang 0,5 U.

A-4 Suhu penyepuhlindapan

■ Suhu penyepuhlindapan terlalu rendah - Menambah suhu penyepuhlindapan dengan tepat atau menggunakan kaedah penyepuhlindapan dua peringkat

Kitaran PCR A-5

■ Terlalu banyak kitaran PCR ——Mengurangkan bilangan kitaran PCR.

Primer A-1- Kekhususan yang buruk - Merancang semula primer, mengubah kedudukan dan panjang primer untuk meningkatkan kekhususannya; atau melakukan PCR bersarang.

DNA Templat A-2

—— Templat itu tidak tulen ——Purnikan templat atau ekstrak DNA dengan alat pemurnian.

A-3 Mg²⁺ kepekatan

——Mg²⁺ kepekatan terlalu tinggi ——Mengurangkan Mg dengan betul²⁺ kepekatan: Mengoptimumkan Mg²⁺ kepekatan oleh rangkaian tindak balas dari 1 mM hingga 3 mM dengan selang 0.5 mM untuk menentukan Mg optimum²⁺ kepekatan untuk setiap templat dan buku asas.

A-4 dNTP

——Kepekatan dNTP terlalu tinggi ——Kurangkan kepekatan dNTP dengan betul

A-5 Suhu penyepuhlindapan

- Suhu penyepuhlindapan yang terlalu rendah - Menambah suhu penyepuhlindapan dengan tepat

Kitaran A-6

—— Terlalu banyak kitaran ——Mengoptimumkan nombor kitaran

Langkah pertama adalah memilih polimerase yang sesuai. Polimerase Taq biasa tidak dapat dikoreksi kerana kekurangan aktiviti eksonuklease 3'-5 ', dan ketidakcocokan akan mengurangkan kecekapan pemanjangan serpihan. Oleh itu, polimerase Taq biasa tidak dapat memperkuat serpihan sasaran yang lebih besar daripada 5 kb. Taq polimerase dengan pengubahsuaian khas atau polimerase kesetiaan tinggi lain harus dipilih untuk meningkatkan kecekapan pemanjangan dan memenuhi keperluan penguatan serpihan panjang. Sebagai tambahan, penguatan serpihan panjang juga memerlukan penyesuaian reka bentuk primer, waktu denaturasi, masa perpanjangan, pH penyangga, dan lain-lain. Biasanya, primer dengan 18-24 bp dapat menghasilkan hasil yang lebih baik. Untuk mengelakkan kerosakan templat, waktu denaturasi pada suhu 94 ° C harus dikurangkan menjadi 30 saat atau kurang setiap kitaran, dan waktu untuk menaikkan suhu hingga 94 ° C sebelum penguatan harus kurang dari 1 menit. Lebih-lebih lagi, menetapkan suhu perpanjangan sekitar 68 ° C dan merancang masa lanjutan mengikut kadar 1 kb / min dapat memastikan penguatan serpihan panjang yang berkesan.

Kadar kesalahan penguatan PCR dapat dikurangkan dengan menggunakan pelbagai polimerase DNA dengan kesetiaan yang tinggi. Di antara semua polimerase DNA Taq yang dijumpai setakat ini, enzim Pfu mempunyai kadar ralat terendah dan kesetiaan tertinggi (lihat jadual terlampir). Sebagai tambahan kepada pemilihan enzim, penyelidik dapat mengurangkan kadar mutasi PCR dengan mengoptimumkan keadaan reaksi, termasuk mengoptimumkan komposisi penyangga, kepekatan polimerase termostabil dan mengoptimumkan bilangan kitaran PCR.