Kit Mutagenesis yang Diarahkan dengan Tapak Pantas

Mutasi laman tunggal atau berbilang tempat yang cepat pada gen sasaran dalam vektor sasaran.

Mutagenesis yang diarahkan di lokasi secara in vitro adalah kaedah eksperimen penting dalam pelbagai bidang biologi dan perubatan, yang kebanyakannya digunakan untuk mengubah dan mengoptimumkan gen sasaran, meneroka tempat pengawal selia, dan juga mengkaji hubungan kompleks antara struktur dan fungsi protein. Kit menggunakan teknologi terkini untuk secara langsung melakukan mutasi laman tunggal, mutasi berbilang laman serta penyisipan atau penghapusan penghapusan pada gen sasaran. Kadar mutasi mutasi satu tempat boleh mencapai lebih dari 90%. Di samping itu, tidak seperti kit mutasi tradisional yang memerlukan PCR berganda, sub-kloning dan langkah-langkah lain yang memakan masa dan tenaga kerja, operasi kit lebih mudah, dan hanya empat langkah diperlukan untuk membina ketegangan mutan.

Kucing. Tidak Saiz Pembungkusan
44992901 20 rxn

 

 


Perincian Produk

Soalan Lazim

Teg Produk

ciri-ciri

■ Mudah dan pantas: Kit menggunakan teknologi penguat plasmid penggantian tanpa helai. Ia hanya memerlukan 4 langkah untuk merealisasikan transformasi dari strain jenis liar menjadi strain mutan, tanpa langkah yang memakan masa dan tenaga kerja seperti PCR dan sub-kloning berganda.
■ Primer kecekapan tinggi: Kit menggunakan prinsip reka bentuk primer yang bertindih sebahagian, sehingga lebih banyak plasmid mutan dapat diperoleh melalui penguatan.
■ Berlaku secara meluas: Kit tidak hanya dapat melakukan mutasi satu tempat, tetapi juga mutasi berbilang tempat. Ia boleh membuat mutasi hingga 5 laman web.
■ Kebolehsuaian yang kuat: Kit ini dapat melakukan mutasi yang diarahkan ke lokasi pada plasmid dengan ukuran maksimum 10 kb, pada dasarnya meliputi semua plasmid yang biasa digunakan.
■ Kadar mutasi tinggi: kit mempunyai fungsi pencernaan berganda templat plasmid metilasi in vitro dan in vivo, memastikan kadar mutasi lebih tinggi.

Penyediaan Reaksi Mutasi Tapak dan Program PCR

■ Untuk mutasi multi-laman primer tunggal, kadar mutasi akan lebih rendah daripada mutasi laman tunggal kerana peningkatan bilangan laman mutasi. Menurut data eksperimen kami, apabila jumlah laman mutasi mencapai 5, kadar positif mutasi akan dikurangkan menjadi 50%. Oleh itu, dalam kes ini, disarankan untuk meningkatkan bilangan klon yang disahkan.
■ Kit ini menyokong mutasi multi-laman web multi-primer, sehingga percubaan mutasi dapat dilakukan secara serentak dalam gen yang lebih luas. Had atas bilangan laman mutasi masih 5.
■ Disarankan agar plasmid dan primer kawalan yang disediakan dalam kit harus digunakan semasa menjalankan eksperimen mutasi baru untuk memudahkan analisis masalah eksperimen.

Fast Site-Directed Mutagenesis Kit Fast Site-Directed Mutagenesis Kit

Semua produk boleh disesuaikan untuk ODM / OEM. Untuk keterangan,sila klik Perkhidmatan Tersuai (ODM / OEM)


  • Sebelumnya:
  • Seterusnya:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    S: Tiada jalur penguat

    Templat A-1

    ■ Templat mengandungi kekotoran protein atau perencat Taq, dan lain-lain —— Sucikan templat DNA, keluarkan kotoran protein atau ekstrak DNA templat dengan alat penulenan.

    ■ Denaturasi templat tidak lengkap - Menambah suhu denaturasi dengan tepat dan memanjangkan masa denaturasi.

    ■ Kerosakan templat ——Menyiapkan semula templat.

    Primer A-2

    ■ Kualiti primer yang buruk ——Menyusun semula primer.

    ■ Degradasi primer ——Ambilkan primer berkepekatan tinggi menjadi sedikit untuk pengawetan. Elakkan pembekuan dan pencairan berulang atau jangka panjang 4 ° C.

    ■ Reka bentuk primer yang tidak betul (mis. Panjang primer tidak mencukupi, dimer terbentuk antara primer, dll.) -Perancangan reka bentuk semula (elakkan pembentukan dimer primer dan struktur sekunder)

    A-3 Mg2+kepekatan

    ■ Mg2+ kepekatan terlalu rendah —— Meningkatkan Mg dengan betul2+ kepekatan: Mengoptimumkan Mg2+ kepekatan oleh rangkaian tindak balas dari 1 mM hingga 3 mM dengan selang 0.5 mM untuk menentukan Mg optimum2+ kepekatan untuk setiap templat dan buku asas.

    A-4 Suhu penyepuhlindapan

    ■ Suhu penyepuhlindapan yang tinggi mempengaruhi pengikatan primer dan templat. ——Mengurangkan suhu penyepuhlindapan dan mengoptimumkan keadaan dengan kecerunan 2 ° C.

    Masa lanjutan A-5

    ■ Masa perpanjangan yang pendek —— Menambah masa lanjutan.

    S: Positif palsu

    Fenomena: Sampel negatif juga menunjukkan jalur urutan sasaran.

    A-1 Pencemaran PCR

    ■ Pencemaran silang dari urutan sasaran atau produk penguat ——Hati-hati untuk tidak memasukkan sampel yang mengandungi urutan sasaran dalam sampel negatif atau menumpahkannya keluar dari tabung empar. Reagen atau peralatan harus ditutup secara autoklaf untuk menghilangkan asid nukleik yang ada, dan keberadaan pencemaran harus ditentukan melalui eksperimen kawalan negatif.

    ■ Pencemaran reagen ——Aliot reagen dan simpan pada suhu rendah.

    A-2 Perdanar

    ■ Mg2+ kepekatan terlalu rendah —— Meningkatkan Mg dengan betul2+ kepekatan: Mengoptimumkan Mg2+ kepekatan oleh rangkaian tindak balas dari 1 mM hingga 3 mM dengan selang 0.5 mM untuk menentukan Mg optimum2+ kepekatan untuk setiap templat dan buku asas.

    ■ Reka bentuk primer yang tidak betul, dan urutan sasaran mempunyai homologi dengan urutan bukan sasaran. --— Reka bentuk primer.

    S: Penguatan tidak spesifik

    Fenomena: Jalur penguat PCR tidak konsisten dengan ukuran yang diharapkan, sama ada besar atau kecil, atau kadang-kadang kedua-dua jalur penguat khusus dan jalur penguat tidak spesifik berlaku.

    Primer A-1

    ■ Kekhususan primer yang lemah

    --— Reka bentuk semula primer.

    ■ Kepekatan primer terlalu tinggi ——Meningkatkan suhu denaturasi dengan betul dan memanjangkan masa denaturasi.

    A-2 Mg2+ kepekatan

    ■ Majlis2+ kepekatan terlalu tinggi ——Mengurangkan kepekatan Mg2 + dengan betul: Optimumkan Mg2+ kepekatan oleh rangkaian tindak balas dari 1 mM hingga 3 mM dengan selang 0.5 mM untuk menentukan Mg optimum2+ kepekatan untuk setiap templat dan buku asas.

    A-3 Polimerase termostabil

    ■ Jumlah enzim yang berlebihan ——Mengurangkan jumlah enzim dengan tepat pada selang 0,5 U.

    A-4 Suhu penyepuhlindapan

    ■ Suhu penyepuhlindapan terlalu rendah - Menambah suhu penyepuhlindapan dengan tepat atau menggunakan kaedah penyepuhlindapan dua peringkat

    Kitaran PCR A-5

    ■ Terlalu banyak kitaran PCR ——Mengurangkan bilangan kitaran PCR.

    S: Jalur tambalan atau smear

    Primer A-1- Kekhususan yang buruk - Merancang semula primer, mengubah kedudukan dan panjang primer untuk meningkatkan kekhususannya; atau melakukan PCR bersarang.

    DNA Templat A-2

    —— Templat itu tidak tulen ——Purnikan templat atau ekstrak DNA dengan alat pemurnian.

    A-3 Mg2+ kepekatan

    ——Mg2+ kepekatan terlalu tinggi ——Mengurangkan Mg dengan betul2+ kepekatan: Mengoptimumkan Mg2+ kepekatan oleh rangkaian tindak balas dari 1 mM hingga 3 mM dengan selang 0.5 mM untuk menentukan Mg optimum2+ kepekatan untuk setiap templat dan buku asas.

    A-4 dNTP

    ——Kepekatan dNTP terlalu tinggi ——Kurangkan kepekatan dNTP dengan betul

    A-5 Suhu penyepuhlindapan

    - Suhu penyepuhlindapan yang terlalu rendah - Menambah suhu penyepuhlindapan dengan tepat

    Kitaran A-6

    —— Terlalu banyak kitaran ——Mengoptimumkan nombor kitaran

    S: Berapa banyak DNA templat yang harus ditambahkan dalam sistem reaksi PCR 50 μl?
    ytry
    S: Bagaimana menguatkan serpihan panjang?

    Langkah pertama adalah memilih polimerase yang sesuai. Polimerase Taq biasa tidak dapat dikoreksi kerana kekurangan aktiviti eksonuklease 3'-5 ', dan ketidakcocokan akan mengurangkan kecekapan pemanjangan serpihan. Oleh itu, polimerase Taq biasa tidak dapat memperkuat serpihan sasaran yang lebih besar daripada 5 kb. Taq polimerase dengan pengubahsuaian khas atau polimerase kesetiaan tinggi lain harus dipilih untuk meningkatkan kecekapan pemanjangan dan memenuhi keperluan penguatan serpihan panjang. Sebagai tambahan, penguatan serpihan panjang juga memerlukan penyesuaian reka bentuk primer, waktu denaturasi, masa perpanjangan, pH penyangga, dan lain-lain. Biasanya, primer dengan 18-24 bp dapat menghasilkan hasil yang lebih baik. Untuk mengelakkan kerosakan templat, waktu denaturasi pada suhu 94 ° C harus dikurangkan menjadi 30 saat atau kurang setiap kitaran, dan waktu untuk menaikkan suhu hingga 94 ° C sebelum penguatan harus kurang dari 1 menit. Lebih-lebih lagi, menetapkan suhu perpanjangan sekitar 68 ° C dan merancang masa lanjutan mengikut kadar 1 kb / min dapat memastikan penguatan serpihan panjang yang berkesan.

    S: Bagaimana meningkatkan kesetiaan pengukuhan PCR?

    Kadar kesalahan penguatan PCR dapat dikurangkan dengan menggunakan pelbagai polimerase DNA dengan kesetiaan yang tinggi. Di antara semua polimerase DNA Taq yang dijumpai setakat ini, enzim Pfu mempunyai kadar ralat terendah dan kesetiaan tertinggi (lihat jadual terlampir). Sebagai tambahan kepada pemilihan enzim, penyelidik dapat mengurangkan kadar mutasi PCR dengan mengoptimumkan keadaan reaksi, termasuk mengoptimumkan komposisi penyangga, kepekatan polimerase termostabil dan mengoptimumkan bilangan kitaran PCR.

    Tuliskan mesej anda di sini dan hantarkan kepada kami